Лаборатория ПЦР

Поскольку накоплен достаточный объем знаний о строении биологических систем не только на макро- , но и на микроуровне. Эти знания представляют ценность прежде всего в аспекте их практического применения.

Знания о ДНК как универсальном носителе наследственной информации всех клеточных организмов (бактерий, грибов, растений, животных и человека), о ее структуре и функционировании способствовали появлению совершенно новых направлений современной биологической науки, имеющих прикладное значение.

Исследование методом ПЦР имеет ряд преимуществ перед привычными способами, так как данный метод ПЦР диагностики позволяет специфично увеличивать (амплифицировать) в сотни раз участок ДНК возбудителя заболевания в исследуемом образце. Теоретически метод ПЦР диагностики позволяет обнаружить даже единственную копию чужеродной ДНК в образце, что позволяет говорить об отсутствии у него предела чувствительности. Кроме высокой чувствительности, исследование методом ПЦР имеет абсолютную специфичность, то есть если метод ПЦР диагностики выполнен правильно, то он не дает ложноположительных результатов.

Материалом для проведения исследований методом ПЦР в нашей лаборатории служит,  как правило, культуральные  жидкости, а также клеточные культуры.

Прежде всего для верифиикации загрязнения клеточных культур микоплазмой.

Микоплазмы представляют большую группу микроорганизмов, которые все характеризуются отсутствием у них жесткой клеточной стенки. Микоплазмы считаются самыми маленькими самовоспроизводящимися организмами, известными в настоящее время. Небольшой размер 0.3- 0,8 мкм в диаметре и гибкость их клеточной мембраны позволяют микоплазме, проникать через поры используемых анти-бактериальных фильтров с диаметром пор 0,45 мкм. В отличие от других бактерий, микоплазмы размножаются медленно, даже при оптимальных условиях. Время удвоения поколения обычно колеблются от одного до трех часов, но есть и такие  штаммы, которые имеют время удвоения до девяти часов; кроме того, микоплазмы имеют относительно длинную лаг-фазу. Поэтому, чтобы получить видимые колонии на агаре при бактериологических исследованиях,  необходимо больше недели. Давно предполагалось, что существуют микоплазмы прикрепляемые только на внешней стороне клеточной мембраны эукариотов. Тем не менее, исследования, проведенные в последние годы, однозначно продемонстрировали внутриклеточное  расположение некоторых mollicutes, не только после фагоцитоза гранулоцитов и моноцитов, но и в не-фагоцитирующих эпителиальных клетках. Более того, выявлен новый вид, способный проникать в различные клетки человека в естественных условиях и in vitro  которые были названы  М. penetrans (Lo и соавт., 1992). В то время как подавляющее большинство населения заражено внеклеточными формами микоплазмы,  внутриклеточное расположение паразита, даже в течение короткого периода времени, изолирует микоплазмы и может их эффективно  защитить при проведении соответствующей терапии.

Микоплазмы были впервые выделены из зараженной культуры клеток в 1956 году.  Одна микоплазма  может дать  рост  до 106 колониеобразующих единиц на мл в течение 3-5 дней в зараженной культуре клеток. Эукариотические клеточные культуры, загрязненные микоплазмами имеют титры в диапазоне от 106 до 108 организмов на мл. Очень часто, наблюдаются от 100 до 1000 микоплазм, прикрепленных к каждой инфицированной клетки. Первичные культуры клеток реже загрязнены, чем постоянные клеточные линии  порядка 1 и 5%, соответственно; зараженность непрерывно культивируемых клеточных линий находится  в диапазоне 15-35% .

В то время как более 20 видов были выделены из загрязненных клеточных линий, детальные исследования отдельных  загрязняющих видов показали, что на сегодняшний день самая большая часть инфекций вызвана небольшим числом Mycoplasma и Acholeplasma: 90-95% контаминаций были идентифицированы как М. Orale, М., М. hyorhinis arginini, M. fermentans, М. HOMINIS или A. laidlawii. Вообще М. Orale, который является наиболее распространенным видом  микоплазм в ротовой полости клинически здоровых людей, и представляет собой наиболее распространенный изолят,  что составляет 20-40% от всех микоплазменных инфекций в культуре клеток. Другие непатогенные виды микоплазмы выделенных из нормальной человеческой микрофлоры ротоглотки, часто заражающие клеточные культуры являются М. fermentans и М. Hominis.

Общие эффекты на эукариотических клетках:

• Измененные уровни белка, синтеза РНК и ДНК
• изменение клеточного метаболизма
• Индукция хромосомных аберраций (численные и структурные изменения)
• изменение клеточной мембраны состава (поверхностного антигена и экспрессии рецепторов)
• Изменение клеточной морфологии
• Влияние на передачу сигнала в клетках
• Продвижение клеточной трансформации
• Изменение характеристик распространения (роста, жизнеспособности)
• Дегенеративные изменения культуры клеток и  их потеря

Для решения вопросов верификации микоплазмы в культуре клеток пациентов в  нашей лаборатории используется метод полимеразной цепной реакции, основанный на следующем оборудовании:
Камера для горизонтального ЭФ (размер геля 110х140 мм) Biometra

Источник питания регулируемый ИПТ-300

Амплификатор «Терцик»

Видеосистема для компьютерного гель-документирования

Четырехканальный ДНК-амплификатор «Терцик» для проведения полимеразной цепной реакции в амплификационных пробирках 0,5 мл., объединяющего 4 независимо управляемых термоблока.

Повышение качества реакции объясняется улучшением условий отжига праймеров, сохранением высокой активности ДНК-полимеразы и уменьшением количества неспецифических продуктов амплификации.

Особенности многоканального амплификатора «Терцик»:

● в каждый термоблок можно устанавливать до 10 пробирок с объемом реакционной смеси от 10 до 50 мкл;

● 3 метода регулирования температуры реакционной смеси:

● пассивный (по температуре блока);

● два активных метода (математическая модель):

● быстрый;

● точный;

● жидкокристаллический графический дисплей позволяет создавать программы и контролировать ход процесса без использования ПК;

● возможность работы в комплексе с любым IBM-совместимым компьютером;

● высокая однородность температуры внутри термоблока;

● бесшумная работа.

Многоканальность прибора позволяет:

● одновременно ставить несколько различных диагностикумов при комплексных исследованиях;

● независимо работать нескольким пользователям;

● ускорить оптимизацию новых реакций;

● обрабатывать до 40 образцов по одной программе при массовых исследованиях.

Для верификации продуктов амплификации используется видеосистема Gel Imager которая  предназначена для ввода в компьютер изображений люминесцирующих следов ДНК в гелях, окрашенных бромистым этидием.

Изображение выводится непосредственно на компьютер. Система устанавливается на рабочее поле трансиллюминатора с рабочим полем до 200х200 мм. Конструкция колпака системы обеспечивает защиту персонала от УФ-излучения трансиллюминатора.

Сигнал изображения формируется ПЗС-камерой с ручной наводкой на резкость, диафрагмированием и 2-х кратным плавным масштабированием. При работе не требуется дополнительного затемнения помещения. Программное обеспечение Gel-Imager поддерживает функции контрастирования, масштабирования, преобразования позитив/негатив, позволяет накапливать кадры в буфер приложения, что значительно поднимает соотношение сигнал/шум. Имеется возможность записи в файл, сжатия, ведения базы данных и печати на принтере полученных изображений.

Технические характеристики:

● Чувствительность не менее 10 нг ДНК при окрашивании бромистым этидием с возможностью ручной регулировки за счет диафрагмирования объектива.

● Размер исследуемого объекта от 90х115 до 170х220 мм с плавным ручным масштабированием.

● Разрешающая способность 768х576 пикселей.

●Запись изображений в файл с возможностью JPEG-компрессии.