Лабораторія ПЛР

Оскільки накопичено достатній обсяг знань про будову біологічних систем не тільки на макро-, але і на мікрорівні. Ці знання є цінністю насамперед в аспекті їх практичного застосування.

Знання про ДНК як універсального носія спадкової інформації всіх клітинних організмів (бактерій, грибів, рослин, тварин і людини), про її структуру та функціонування сприяли появі абсолютно нових напрямків сучасної біологічної науки, що мають ужиткове значення.

Дослідження методом ПЛР має низку переваг перед звичними способами, оскільки даний метод ПЛР діагностики дозволяє специфічно збільшувати (ампліфікувати) в сотні разів ділянку ДНК збудника захворювання в досліджуваному зразку. Теоретично метод ПЛР діагностики дозволяє виявити навіть єдину копію чужорідної ДНК в зразку, що дозволяє говорити про відсутність у нього межі чутливості. Крім високої чутливості, дослідження методом ПЛР має абсолютну специфічність, тобто якщо метод ПЛР діагностики виконаний правильно, то він не дає хибнопозитивних результатів.

Матеріалом для проведення досліджень методом ПЛР в нашій лабораторії служать, як правило, культуральні рідини, а також клітинні культури.

Перш за все для верифікаціі забруднення клітинних культур мікоплазмою.

Мікоплазми являють велику групу мікроорганізмів, які характеризуються відсутністю в них жорсткої клітинної стінки. Мікоплазми вважаються найменшими самовідтворними організмами, відомими на даний час. Невеликий розмір 0,3- 0,8 мкм в діаметрі і гнучкість їх клітинної мембрани дозволяють мікоплазмі, просякати через пори використовуваних антибактеріальних фільтрів з діаметром пор 0,45 мкм. На відміну від інших бактерій, мікоплазми розмножуються повільно навіть в оптимальних умовах. Час подвоєння покоління зазвичай коливається від однієї до трьох годин, але є і такі штами, які мають час подвоєння до дев’яти годин; крім того, мікоплазми мають відносно довгу лаг-фазу. Тому, щоб отримати видимі колонії на агарі при бактеріологічних дослідженнях, необхідно більше тижня. Давно передбачалося, що існують мікоплазми, що прикріплюються тільки на зовнішній стороні клітинної мембрани еукаріотів. Проте дослідження, проведені в останні роки, однозначно продемонстрували внутрішньоклітинне розташування деяких mollicutes, не тільки після фагоцитозу гранулоцитів і моноцитів, але і в не-фагоцитируючих епітеліальних клітинах. Більш того, виявлено новий вид, здатний проникати в різні клітини людини в природних умовах і in vitro, який було названо М. penetrans (Lo і співавт., 1992). У той час як переважна більшість населення заражена позаклітинними формами мікоплазми, внутрішньоклітинне розташування паразита, навіть протягом короткого періоду часу, ізолює мікоплазми та може їх ефективно захистити при проведенні відповідної терапії.

Мікоплазми були вперше виділені з зараженої культури клітин в 1956 році. Одна мікоплазма може надати зростання до 106 колонієутворюючих одиниць на мл протягом 3-5 днів в зараженій культурі клітин. Еукаріотичні клітинні культури, забруднені мікоплазмами мають титри в діапазоні від 106 до 108 організмів на мл. Дуже часто спостерігається від 100 до 1000 мікоплазм, прикріплених до кожної інфікованої клітини. Первинні культури клітин рідше забруднені, ніж постійні клітинні лінії, – близько 1 і 5% відповідно; зараженість клітинних ліній, що безперервно культивуються, знаходиться в діапазоні 15-35%.

У той час як понад 20 видів були виділені із забруднених клітинних ліній, детальні дослідження окремих забруднюючих видів показали, що на сьогодні найбільша частина інфекцій викликана невеликою кількістю Mycoplasma і Acholeplasma: 90-95% контамінацій були ідентифіковані як М. Orale, М. , М. hyorhinis arginini, M. fermentans, М. HOMINIS або A. laidlawii. Взагалі М. Orale, який є найбільш поширеним видом мікоплазм в ротовій порожнині клінічно здорових людей, і являє собою найбільш поширений ізолят, що становить 20-40% від усіх мікоплазмових інфекцій в культурі клітин. Іншими непатогенними видами мікоплазми, виділеними з нормальної людської мікрофлори ротоглотки, що часто заражають клітинні культури, є М. fermentans і М. Hominis.

Загальні ефекти на еукаріотичних клітинах:

• змінені рівні білка, синтезу РНК і ДНК.
• зміна клітинного метаболізму.
• індукція хромосомних аберацій (чисельні і структурні зміни).
• зміна клітинної мембрани складу (поверхневого антигену та експресії рецепторів).
• зміна клітинної морфології.
• вплив на передачу сигналу в клітинах.
• просування клітинної трансформації.
• зміна характеристик поширення (зростання, життєздатності).
• дегенеративні зміни культури клітин і їх втрата.

Для вирішення питань верифікації мікоплазми в культурі клітин пацієнтів в нашій лабораторії використовується метод полімеразної ланцюгової реакції, заснований на наступному обладнанні:

1. Камера для горизонтального ЕФ (розмір гелю 110х140 мм) Biometra
2. Джерело живлення регульоване ИПТ-300
3. Ампліфікатор «Терцик»
4. Відеосистема для комп’ютерного гель-документування.

Чотириканальний ДНК-ампліфікатор «Терцик» для проведення полімеразної ланцюгової реакції в ампліфікаціонних пробірках 0,5 мл, що об’єднує 4 незалежно керованих термоблока.

Підвищення якості реакції пояснюється поліпшенням умов відпалу праймерів, збереженням високої активності ДНК-полімерази і зменшенням кількості неспецифічних продуктів ампліфікації.

Особливості багатоканального ампліфікатора «Терцик»:

● у кожен термоблок можна встановлювати до 10 пробірок з об’ємом реакційної суміші від 10 до 50 мкл;

● 3 методи регулювання температури реакційної суміші:

● пасивний (по температурі блоку);

● два активних методи (математична модель):

● швидкий;

● точний;

● рідкокристалічний графічний дисплей дозволяє створювати програми і контролювати хід процесу без використання ПК;

● можливість роботи в комплексі з будь-яким IBM-сумісним комп’ютером;

● висока однорідність температури всередині термоблока;

● безшумна робота.

Багатоканальність приладу дозволяє:

● одночасно ставити кілька різних діагностикумів при комплексних дослідженнях;

● незалежно працювати декільком користувачам;

● прискорити оптимізацію нових реакцій;

● обробляти до 40 зразків за однією програмою при масових дослідженнях.

Для верифікації продуктів ампліфікації використовується відеосистема Gel Imager, яка призначена для введення в комп’ютер зображень люмінесцуючих слідів ДНК в гелях, забарвлених бромистим етидієм.

Зображення виводиться безпосередньо на комп’ютер. Система встановлюється на робоче поле трансілюмінатора з робочим полем до 200х200 мм. Конструкція ковпака системи забезпечує захист персоналу від УФ-випромінювання трансілюмінатора.

Сигнал зображення формується ПЗС-камерою з ручним наведенням на різкість, діафрагмуванням і подвійним поступовим масштабуванням. Під час роботи не потрібно додаткового затемнення приміщення. Програмне забезпечення Gel-Imager підтримує функції контрастування, масштабування, перетворення позитив / негатив, дозволяє накопичувати кадри в буфер додатку, що значно піднімає співвідношення сигнал / шум. Є можливість запису в файл, стиснення, ведення бази даних і друку на принтері отриманих зображень.

Технічні характеристики:

● Чутливість не менше 10 нг ДНК при забарвленні бромистим етидієм з можливістю ручного регулювання за рахунок діафрагмування об’єктива.

● Розмір досліджуваного об’єкта від 90х115 до 170х220 мм з плавним ручним масштабуванням.

● Роздільна здатність 768х576 пікселів.

● Запис зображень в файл з можливістю JPEG-компресії.